Phương pháp điện di trên gel agarose

Cặn hòa lại trong 500 – 700 µl 10 glycerol.Chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C.Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điệnVector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ngµl.Làm tan tế bào khả biến TBKB trên đá 30 phút.Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai.Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet.Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ.Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điệnmột chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương.Quy trình:Agarose 0,8 được đun sơi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khigel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.32Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừngvào thời gian phù hợp thường sau khoảng 30 phút.Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10µ gml trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửasạch bản gel bằng nước cất.Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio –Rad với tia UV có bước sóng 320 nm.Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chếnguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNApolymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khn trong mơi trường có dư các dNTP và cặpmồi đặc hiệu. Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn.Tiếp hợp đoạn mồi primer thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắcbổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C.Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thựctế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của33hai đoạn mồi. PCR bao gồm các thành phần sau đây:Một đoạn DNA khn.Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide.Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate dATP, dTTP, dGTP, dCTP.Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8.Thành phần phản ứng chạy PCR: dNTPs 10 mM :1 µl Buffer 10 X :2.5 µl Primer F 10 µM:1 µl Primer R 10 µM:1 µl Taq 5 Uul:0.2 µl H2O: 18.3µ lDNA plasmid: 2µ lTổng thể tích: 25µ lChu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph: 94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C5 phút 43 giây 1 phút 1 phút25chu kỳ10 phút

Điện DI GEL AGAROSE và ứng dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây [812.79 KB, 19 trang ]

EBOOKBKMT.COM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Bài báo cáo:

ĐIỆN DI GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG

Giảng viên

:

TS Võ Minh Trí

Danh sách nhóm:
Phan Duy Luân
MSSV: 0853010470
Đoàn Thị Thiên Trang MSSV: 0853010961

TP Hồ Chí Minh, ngày 28, tháng 10, năm 2010

1


EBOOKBKMT.COM

MỤC LỤC
I. GIỚI THIỆU CHUNG
1.Điện di

2. Phân loại
3. Nguyên tắc thực hiện
II. ĐIỆN DI TRÊN AGAROSE GEL
1.Giới thiệu về agarose
2. Agarose gel
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel
3.1. Kích thước của phân tử
3.2. Nồng độ agarose
3.3. Cấu hình của DNA
4.Thành phần thực hiện điện di
4.1. Agarose
4.2. Lược
4.3. Khuôn gel
4.4. Máy điện di
5. Phương pháp điện di agarose gel
5.1. Đệm pH
5.2. Chuẩn bị agarose gel
5.3. Nhuộm DNA trong agarose gel
5.4. Thu hồi DNA từ agarose gel
5.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp [low melting temperature]
5.4.2. Ly tâm
5.4.4. Dùng hạt thủy tinh
5.4.3. Điện di vào bẫy
6. Các bước thực hiện
6.1. Chuẩn bị gel agarose
6.2. Tiến hành điện di
6.3. Nhuộm DNA bằng EtBr
6.4. Kiểm tra băng AND
III.ỨNG DỤNG
2

EBOOKBKMT.COM
1. Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose
2.Tinh sạch và thu nhận mẫu
3. Định tính và định lượng thô nucleic acid
4. Một số ví dụ
I. GIỚI THIỆU CHUNG
1.Điện di:
- Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện
trường. Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di trên gel [gel
electrophoresis] áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc
điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích [isoelectic
point]. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm [buffer] để dẫn điện và tạo điện
trường đều. Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất
chất nhuộm khác nhau [ethumdromide, xanh coomassie, bạc…] để phát hiện vị trí các
phân tử gel sau khi điện di.
- Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử
đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tích
và cấu hình của chúng.
- Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển
hướng đến cực dương [+] hoặc cực âm [-] tùy theo điện tích của chúng. Ngược với
protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một
điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển
hướng đến cực dương.
- Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ
[support matrix] như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide
gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông
thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp [loading] mẫu.
Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một

vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối.
2. Phân loại
Gel được cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành một
hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân
tử và phản ứng tạo liên kết chéo. Các kiểu điện di:
 Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb
 Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb
 Ngoài ra còn điện di trong trường xung [PFGE _ Pulse Field Gel
Electrophonesic]

3


EBOOKBKMT.COM

3. Nguyên tắc thực hiện
- Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử
tích điện và kích thướt lỗ của thể nền [gel].
- Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốc
khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:
 Lực điện trường tác động lên chúng[nếu các phân tử tích điện khác nhau]
 Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel
 Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử
II. ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE
1.Giới thiệu về agarose
- Agarose [polysaccharide] có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da là một trong hai
thành phần chính của agarose chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm
khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc
xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong
suốt [transparent] hoặc trong mờ [transluent] giống như agar, được tạo thành khi hỗn

hợp agarose và nước [hoặc đệm điện di] được đun nóng tới >100 oC và sau đó được
làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi
để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang [horizontal
electrophoresis] hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage [top
agarose].
- Agarose được tách ra ở dạng thạch từ một số loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển , được
tìm thấy tại California và miền đông châu Á. Agar, một thuật ngữ có nguồn gốc từ chữ
thạch agar-Malay, có nghĩa là sữa ong chúa, là thường bắt nguồn từ các chi Gelidium
rong biển. Nó bao gồm cả phân tử agarose và agaropectin và cung cấp hỗ trợ cho các
thành tế bào trong tảo biển.Agar được sử dụng như một chất làm đặc thức ăn, giống
như gelatin, hoặc một phương tiện cho vi khuẩn phát triển, nấm, hoặc các vi sinh vật
khác.

4


EBOOKBKMT.COM

Hình : Cấu trúc phân tử của
agarose. Đơn vị agarobiose [ví dụ: hai phân tử đường] là một monomer trong
agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer.

2. Agarose gel
- Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường
dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb. Gel được đổ
trên một giá thể nằm ngang và được điện di được thực hiện theo phương nằm ngang.
- Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di
chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và
cường độ thích hợp. Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của
DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng

độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide [EtBr] và có thể phát hiện
dưới ánh sáng tử ngoại [ultraviolet-UV].
- Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose,
người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử [monocular weigth marker
– MWN]. Đó là một trình tự DNA có kích thước đã biết [thang DAN – DNA ladder],
thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực thể  được thủy giải bởi enzyme
giới hạn HindIII
5


EBOOKBKMT.COM

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel
3.1. Kích thước của phân tử
Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với
hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng. Do đó, các phân tử DNA có kích thước
càng lớn [khối lượng phân tử lớn] thì tốc độ dịch chuyển càng chậm.
3.2. Nồng độ agarose
Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua
các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có
kích thước khác nhau]. Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA
nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn.

Bảng: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel
3.3. Cấu hình của DNA
Các DNA dạng vòng đóng [form-I], vòng đứt [form-II] và mạch thẳng [form-III] có
cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau.
Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của
plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít

nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng [siêu xoắn]
và vòng đứt.
4.Thành phần thực hiện điện di
4.1. Agarose
Agarose là dẫn xuất polysaccharide từ agar [thạch] có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều
loại agarose khác nhau về độ điện môi, nhiệt độ nóng chảy, độ trong, độ cứng. agarose
6


EBOOKBKMT.COM
thường được cung cấp dưới dạng bột khô. Khi cho vào đệm sôi nó sẽ tan và giữ được
trạng thái lỏng cho đến khi tạo gel khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40°C. Khi đã đông
gel ổn định ở nhiệt độ thấp hơn. Kích thước mạng lưới và đặc tính sàn lọc phụ thuộc
vào nồng độ agarose trong gel. Nồng độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ. Nồng độ thích
hợp là 0,4% đến 4%.
4.2. Lược
Dùng để tạo ra các giếng trong bản gel
4.3. Khuôn gel:
Nơi đổ gel lên

Hình: Thành phần thực hiện điện di
4.4. Máy điện di
- Buồng đệm được tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer [tạo bề
dày] ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín [H. 1.4]. Gel bản có
kích thước từ 2,5 cm2 [giữa hai lamen của kính hiển vi] đến 30.15 cm2 và độ dày từ
10 mm.
- Điện cực.
- Máy điện di

7

EBOOKBKMT.COM

Hình ảnh về thiết bị điện di agarose
5. Phương pháp điện di agarose gel
5.1. Đệm pH
Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetateEDTA [TAE], Tris-borate-EDTA [TBE] và Tris-phosphate-EDTA [TPE] ở nồng độ
khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8. Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất,
nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt
các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịch
chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau
về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung
cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn [conductivity]. Nếu chúng ta dùng nước thay vì là
đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong
gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc [ví dụ: dung dịch stock ×10], thì
nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó.
5.2. Chuẩn bị agarose gel
Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất
trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp [low-endo-osmotic]. Nó dê
dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở
các nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose dê bị bẩn bởi sulphate polysaccharides

8


EBOOKBKMT.COM
[SP], hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, các
đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng
được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này.

5.3. Nhuộm DNA trong agarose gel
Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm
huỳnh quang EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy
nhiên, ái lực [affinity] của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp
và có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các
base của nucleic acid và cho phép phát hiện dê dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính
linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm [khoảng
15%], nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình
điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di
gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. 45Gel được
ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr [0,5 phút ở nhiệt độ phòng].
Chú ý : Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh, chất độc gây ung thư,
vì vậy cần luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc
nhuộm,tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khi
sử dụng, không được thải ra ngoài môi trường khi chưa được xử lý thích hợp.

Cấu trúc ethidium bromide
5.4. Thu hồi DNA từ agarose gel
Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không
có phương pháp nào là hoàn toàn tối ưu. Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại
agarose đều bị nhiêm bẩn bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được
chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố ức chế có hoạt tính của nhiều loại

9


EBOOKBKMT.COM
enzyme [RE, ligase, kinase, polymerase] dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau;
thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của nó,
các đoạn DNA có chiều dài 20 kb được
thu hồi kém [khoảng hơn 20% sản lượng]. Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch
DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính:
5.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp [low melting temperature]
Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra
khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau
đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA
được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng
phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện
diện của các nhân tố ức chế trong agarose.
5.4.2. Ly tâm
Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm
nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp [màng] bông
thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL [còn gọi là spin
column]. Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc
độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch
đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột
vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào
cột và ly tâm để dung ly [elution] DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu
được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi
dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.
5.4.3. Điện di vào bẫy
Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan
tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để
chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol [quá trình điện di có thể được kiểm
soát bằng UV]. Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi
điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt
trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA
quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được
dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể được

tách chiết bằng phenol và kết tủa.
5.4.4. Dùng hạt thủy tinh

10


EBOOKBKMT.COM
Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI [một loại chaotropic salt]
ở nồng độ khoảng 4M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên
kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA,
protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu
kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm
muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm
vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ [500-800 bp] là không hiệu quả lắm và các
đoạn lớn [>15 kb] có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có
thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.
6. Các bước thực hiện

6.1. Chuẩn bị gel agarose
- Cho lượng thích hợp agarose và dung dịch đệm vào bình tam giác.
- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng.
Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel

11


EBOOKBKMT.COM
sôi thì cắt điện, lấy ra [coi chừng bỏng] lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa. Lặp lại ba
lần cho agarose tan hoàn toàn.
- Cho vào chậu bảo ôn ~50°C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 60 °C [tay chạm vào được] thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium

bromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50 μg/ml. [Nếu
không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thì
ngâm
bản
gel
vào
dung
dịch
này
sau
khi
đã điện
di].
- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn
lược và đặt trên mặt phẳng
- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.
6.2. Tiến hành điện di
- Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang,
rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode.
- Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu [điện di] 6× hoặc bằng hợp
chất màu tương tự. Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo động
bởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và
có màu rõ ràng. Dung dịch màu tải mẫu 6× [dịch nạp mẫu] chứa 30% glycerol, 0,25%
bromophenol blue [BPB] và 0,25% xylencyanol [XC].
- Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược.

12


EBOOKBKMT.COM

- Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ dòng điện khoảng 50 đến 150 V
tùy loại thiết bị điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA,
nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Chú ý lượng DNA có thể điện di
trong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện
hiện tượng "tailing" [kéo đuôi] khó phân li.

13


EBOOKBKMT.COM
6.3. Nhuộm DNA bằng EtBr
Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch
EtBr nồng độ 0,5 gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ [độ 10 vòng/phút ].
Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm
trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5
mg/mL và giữ ở 4oC trong tối.
6.4. Kiểm tra băng ADN
- Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh = 302 nm. Dùng thiết bị
chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA [Gel Documentation System].
Chú ý: không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp.
- Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại [UV]
nucleid acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam.

14


EBOOKBKMT.COM
- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel
30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml.

- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống
kính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết
bị
phân
tích
gel
số
hóa
[gel
documentation
system].
Chú ý: Đèn tử ngoại [UV] có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm
[UV sóng ngắn] và 366 nm [UV sóng dài]. UV sóng ngắn giúp quan sát rõ
DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu cần thu hồi DNA
từ gel thì không nên áp dụng

Hệ thống chụp ảnh điện di geldoc XP của Biorad

15


EBOOKBKMT.COM

A. Kết quả điện di trên gel agarose chụp bằng ánh sáng UV
B. Kết quả Western blot chụp bằng ánh sáng trắng
III. ỨNG DỤNG
- Agarose gel điện là một phương pháp sử dụng rộng rãi việc chia tách các phân tử
trên cơ sở tính phí điện, kích thước và hình dạng. Phương pháp này đặc biệt hữu ích
trong việc tách các phân tử sinh học tính quan trọng như DNA [deoxyribonucleic
acid], RNA [ribonucleic acid], và protein.

- Agarose gel là một chất được sử dụng trong khoa học cho điện gel và sắc ký loại trừ
kích cỡ. Sử dụng agarose gel để tách và phân tích protein và DNA . Phương tiện bao
gồm một bột agarose tinh khiết đã được đun sôi trong một dung dịch đệm và sau đó
làm lạnh.
1. Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose:
- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế
[ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng...].
- Phân tích các sản phẩm PCR [ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di
truyền...].
- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA
trước khi thẩm tích Northern.

16


EBOOKBKMT.COM
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dê dàng, không gây biến tính mẫu, và
bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dê thu hồi.
Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị
tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.
2. Tinh sạch và thu nhận mẫu
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi
lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Sau khi
điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại
theo một trong những phương pháp:
 Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được
thu nhận sau khi đã khuếch tán phân tử gel agarose vào một dung dịch đệm
thích hợp.
 Phương pháp 2: một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch
DNA. “giếng” này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái

lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dich đệm và được thu nhận
lại.
 Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt [như
Nusieve hay Seaplaque] có điểm nóng chảy rất thấp [65°]. Sau điện di vạch
DNA được cắt ra, ủ trong một dung dịch đệm ở 65°. Khi agarose đã hoàn
toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.
3. Định tính và định lượng thô nucleid acid
Sau khi thu nhận nucleid acid ở dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính và
định lượng chúng:
 Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thướt…
 Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng
4. Một số ví dụ
4.1. Ví dụ 1:
Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra ADN tổng số tách từ các chủng
B. THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập: từ kênh [1-10] theo thứ tự [47S, 50S,
H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ].

17


EBOOKBKMT.COM

Qua ảnh điện di các mẫu ADN tổng số tách được từ 10 chủng B. thuringiensis
kurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét ở phía trên của bản gel,
không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và không bị đứt gãy,
đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.Ví dụ 2:
Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR
đặc hiệu của gen cry1Ab cắt bằng EcoR I.
Chú thích:

Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab
Kênh 2,3,5: Plasmid cắt bằng EcoR I
Kênh 4: Slasmid của khuẩn lạc xanh
Kênh 6: Chỉ thị phân tử [ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuống 21226,
5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp].
Kết quả ở hình cho thấy khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi enzym EcoR I đoạn ADN
đặc hiệu của gen cry1Ab được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sản
phẩm PCR của đoạn ADN này [ Kênh 1 và 2, 3, 5]. Kênh 2 cho thấy plasmid của
khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích
thước vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid.

18


EBOOKBKMT.COM

19