Gene e covid là gì

Mới đây, liên quan đến các thông tin ban đầu về kết quả xét nghiệm "dương tính yếu" Covid-19. nhiều ý kiến bạn đọc Báo Thanh Niên băn khoăn về khái niệm "dương tính yếu" này. PV Thanh Niên đã trao đổi với TS.BS Trần Tôn, Viện Pasteur TP.HCM để giải đáp các thắc mắc nêu trên.

Số ca Covid-19 trong vòng 24 giờ của toàn thế giới đạt kỷ lục mới

Có 2 phương pháp xét nghiệm Covid-19

Theo TS.BS Trần Tôn, dương tính với CoVid-19, theo quan điểm từ phòng xét nghiệm, nghĩa là xét nghiệm phát hiện có vật liệu di truyền [RNA] của Covid-19 [SARS-CoV-2] trong bệnh phẩm.

Còn âm tính với Covid-19 là khi không phát hiện được vật liệu di truyền [RNA] của Covid-19 trong bệnh phẩm.

Xét nghiệm Covid-19 tại Viện Pasreur TP.HCM.

Ảnh: Duy Tính

Hiện nay, theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới [WHO] và Trung tâm kiểm soát, phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ [US CDC], xét nghiệm realtime RT PCR được dùng chủ yếu để để chẩn đoán nhiễm Covid-19.

Đây là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép đọc được tín hiệu trong mẫu [nếu có] theo thời gian thực [realtime]. Nghĩa là nếu trong mẫu có chất liệu di truyền của tác nhân cần tìm thì sau một số chu kỳ khuếch đại nhất định, tín hiệu trong mẫu sẽ vượt tín hiệu nền và được thiết bị ghi nhận, gọi là Ct [Cycle threshold] của mẫu.

Đối với xét nghiệm định tính, mỗi phòng xét nghiệm khi thiết lập phương pháp sẽ phải đánh giá và xác định giá trị ngưỡng kỹ thuật của phương pháp sử dụng [gọi là Ct ngưỡng hay Cut-off] tương ứng với giới hạn phát hiện [LOD] của phương pháp. Và như vậy, các phòng xét nghiệm sử dụng quy trình xét nghiệm khác nhau có thể có giá trị Ct ngưỡng cũng khác nhau.

Tại Việt Nam, có 2 quy trình được sử dụng phổ biến ở các phòng xét nghiệm chẩn đoán CoVid-19 là quy trình của Charite – Berlin theo khuyến cáo của WHO [đích phát hiện là gen E và gen RdRp của Covid-19], và quy trình của US.CDC [đích phát hiện là 2 đoạn khác nhau trên gen N của Covid-19].

\n

“Khu nhà giàu” Thảo Điền ở TP.HCM mừng hú hồn vì người Indonesia đã âm tính Covid-19

Thận trọng nên ghi kết quả:  "dương tính yếu - nhẹ"

Khi xét nghiệm chẩn đoán Covid-19 bằng kỹ thuật realtime RT PCR, thì kết quả xét nghiệm sẽ được thể hiện là dương tính với Covid-19 [phát hiện RNA của Covid-19 trong mẫu thử] khi giá trị Ct của mẫu thử nhỏ hơn giá trị Ct ngưỡng [Ví dụ: với quy trình Berlin sử dụng tại Viện Pasteur TP.HCM, giá trị Ct ngưỡng là 37 đối với gen E và 40 đối với gen RdRp; mẫu xét nghiệm có tín hiệu ghi nhận trên cả 2 đoạn gen ở Ct 30 thì mẫu này kết luận dương tính].

Nều kết quả là âm tính với Covid-19 [không phát hiện RNA của Covid-19 trong mẫu thử] khi không ghi nhận được tín hiệu trong mẫu.

Xét nghiệm Covid-19.

Ảnh: Duy Tính

Trường hợp những mẫu có Ct tiệm cận với Ct ngưỡng và có tín hiệu rõ, thì phải lặp lại xét nghiệm trên các gen đích cùng lúc để kiểm tra, và nếu kết quả vẫn lặp lại như vậy thì phòng xét nghiệm thường thận trọng trả kết quả dưới dạng “dương tính yếu - nhẹ”, nhằm lưu ý nhiều hơn rằng việc biện giải kết quả xét nghiệm cần phải được kết hợp chặt chẽ với các dữ liệu dịch tễ và lâm sàng.

Không có khái niệm kết quả “âm tính yếu - nhẹ” khi xét nghiệm bằng kỹ thuật này.

Theo TS.BS Trần Tôn, cần lưu ý thêm là với xét nghiệm realtime RT-PCR, khả năng và tỷ lệ phát hiện vật liệu di truyền [RNA] của Covid-19 có thể thay đổi theo giai đoạn của bệnh, ở từng loại bệnh phẩm, từng lần lấy bệnh phẩm khác nhau cho dù trên cùng một người.

 Xôn xao vì thông tin nam bệnh nhân người Indonesia 'dương tính yếu' Covid-19

Nam bệnh nhân [31 tuổi, quốc tịch Indonesia] nhập cảnh vào sân bay Tân Sơn Nhất ngày 11.3. Nam bệnh nhân cư ngụ tại TT Bến Cát, Bình Dương và làm việc tại một công ty ở H.Bàu Bàng, tỉnh Bình Dương.

Nam bệnh nhân muốn lấy giấy xác nhận không dương tính với Covid-19 để về nước nên ngày 30.6 nam bệnh nhân cùng 1 đồng nghiệp đến TP.HCM và đến một phòng khám ở P.Thảo Điền, Q.2, TP.HCM. Do phòng khám này không đủ điều kiện xét nghiệm Covid-19 nên đã lấy mẫu và chuyển sang Bệnh viện FV vào sáng 30.6.

Theo báo cáo của Bệnh viện FV, đến 18 giờ cùng ngày [30.6], sau khi có kết quả xét nghiệm "dương tính nhẹ" với Covid-19, bệnh viện này đã trả kết quả cho phòng khám gởi mẫu, đồng thời thông tin cho HCDC và Sở Y tế TP.HCM. Mẫu bệnh phẩm được chuyển đến Bệnh viện Bệnh nhiệt đới kiểm tra chéo theo quy định của Bộ Y tế.

Kết quả lấy mẫu, xét nghiệm lại vào ngày 1.7, Viện Pasteur TP.HCM kết luận bệnh nhân âm tính với Covid-19.

*Gen mã hóa các Protein trên được sử dụng để sản xuất các bộ test chẩn đoán Corona virus. Trong khi BV Charité [Berlin - Đức], ĐH Timone [Marseille - Pháp] sử dụng gen “E”, Công ty Altona Diagnostics [Hamburg - Đức] sử dụng gen “S”, thì CDC [Trung Quốc] và Đại học Quân Y Việt Nam cùng sử dụng gen “N”. 

• Dựa trên nguyên lý kết hợp Kháng nguyên - Kháng thể: Khi có 1 tác nhân ngoại lai, độc hại xâm nhập cơ thể sẽ bị hệ thống miễn dịch của cơ thể phát hiện và khởi động 2 cơ chế bảo vệ:

       -    Miễn dịch tế bào: Các đại thực bào [marcrophage] sẽ tiêu hủy các virus này theo cơ chế “ăn” và “tiêu hóa” chúng.
       -    Miễn dịch dịch thể: Các tế bào lympho sẽ bám vào các virus, nhận diện chúng sau đó giúp cơ thể sản xuất các kháng thể đặc hiệu [là các immunoglobulin miễn dịch - Ig M, Ig G], do đó kháng thể được sản xuất là duy nhất và đặc hiệu cho 1 loại cấu trúc kháng nguyên. Sau khi được hình thành kháng thể sẽ gắn vào kháng nguyên để tạo thành 1 phức hợp miễn dịch bất hoạt kháng nguyên [virus] đó.
Do kháng thể phải mất vài ngày thậm chí vài tuần để phát triển sau khi người      bệnh [NB] nhiễm virus và có thể tồn tại trong máu NB vài tuần hoặc hơn sau khi khỏi bệnh [y học hiện nay chưa xác định được thời gian kháng thể được hình thành sẽ tồn tại bao nhiêu lâu trong máu sau khi nhiễm virus], nên test nhanh kháng thể có “lỗ hổng” [-] dài và khi [+] phải xác định bằng XN Real time - RT - PCR để khẳng định NB có đang nhiễm virus?

• Có 2 loại xét nghiệm [XN] kháng thể:

       -    Phương pháp Elisa: Giúp định lượng kháng thể có kết quả sau 1 – 5h.
       -    Sắc ký miễn dịch [test nhanh] có giá trị định tính cho kết quả trong vòng 30 phút.

• Mẫu để làm XN: Máu [huyết tương] của NB nên bệnh phẩm phải được lấy tại Phòng Xét nghiệm.
• Kết quả:

       -    Âm tính: NB mới nhiễm virus cơ thể chưa sản xuất đủ lượng kháng thể để xác định.
       -    Dương tính: Khẳng định NB đã bị nhiễm hoặc đang nhiễm virus.. Những NB có test nhanh kháng thể [+] phải được làm XN Real time - RT- PCR để xác định chẩn đoán.

       2. Test nhanh kháng nguyên

• Dựa trên nguyên lý phát hiện virus SARS - COV - 2 có trong dịch Tỵ - Hầu của NB. Test nhanh kháng thể cho kết quả tốt nhất trong vòng 5 – 7 ngày sau khi khởi phát triệu chứng và giảm xuống dưới ngưỡng phát hiện cũng sau thời gian này. Như vậy về lỗ hổng “cửa sổ” nhiễm bệnh cả test nhanh kháng nguyên và test nhanh kháng thể đều có, chỉ khác test nhanh kháng nguyên có thời gian “lỗ hổng” ngắn hơn. Đây cũng là cơ sở để yêu cầu nhân viên y tế, nhân viên tham gia công tác phòng chống dịch, NB và người chăm sóc bệnh tại các Bệnh viện đang điều trị cho NB COVID - 19 phải được tầm soát bằng test nhanh kháng nguyên định kỳ.
• Mẫu để làm XN: Dịch Tỵ - Hầu nên có thể lấy mẫu bên ngoài phòng XN [đây là ưu điểm nổi trội của test nhanh kháng nguyên so với kháng thể]. Cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút [tương đương test nhanh kháng thể].
• Ở 1 số quốc gia test nhanh kháng nguyên có thể được làm tại nhà được gọi là: “Trực tiếp cho người có nhu cầu “ [DTC - Dỉrect to Consumer] hoặc “không kê đơn” [OTC - Over the Counter], các test DTC và OTC có thể mua tại các nhà thuốc thậm chí siêu thị.
• Kết quả:

       -    Âm tính có 3 khả năng:
           + NB không nhiễm SARS - COVI – 2.
           + Chưa đủ tải lượng virus [mới nhiễm].
           + Kỹ thuật lấy mẫu không đúng.
       -   Dương tính: Do độ nhạy thấp nên chỉ có giá trị sàng lọc, đồng nghĩa NB có test nhanh kháng nguyên [+], phải được làm XN Real time - RT - PCR để xác định chẩn đoán.

      3. Xét nghiệm Real time - RT - PCR

Trước khi tìm hiểu RT - PCR, chúng ta xem lại XN PCR [Polymerase Chain Reaction] - Phản ứng khuyếch đại gen hay Phản ứng chuỗi trùng hợp: Đây là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một đoạn DNA [làm cho đoạn DNA đó nhân lên nhiều triệu lần trong 1 thời gian ngắn bằng cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi Enzym DNA polymerase] để dễ dàng nghiên cứu. Vì vậy có thể coi PCR là XN “Định danh” ở mức phân tử.
     a] Nguyên lý của XN PCR: 

• Tác nhân gây bệnh sau khi được lấy mẫu sẽ bị phá bỏ màng bọc để bộc lộ DNA hoặc RNA [các Retrovirus có mã di truyền là RNA nên phải trải qua quá trình phiên mã ngược - Reverse Transcriptase/RT nhằm tạo ra DNA để nhân bản]. 
• Trước hết sợi DNA kép được làm nóng ở nhiệt độ 96 độ C để tách thành 2 sợi đơn. Tuy nhiên ở nhiệt độ này polymerase của các loại vi sinh được nghiên cứu sẽ bị phá hủy, vì vậy người ta phải sử dụng polymerase thay thế được lấy từ các loài vi khuẩn ưa nhiệt [thermophilic] có ở suối nước nóng, DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập từ Thermus Aquaticus [Taq], nhưng do loại này có nhiều lỗi trong quá trình sao chép, nên người ta chuyển sang sử dụng P.fu [Pyrococcus Furiosus] là các loại VK có ở miệng núi lửa hoặc Pwo [Pyrococcus Woesei] có trong các lớp trầm tích dưới đáy đại dương. Và ngày nay để có được sao chép ngày càng chính xác hơn người ta đã phát hiện thêm nhiều loài Thermococcus khác. Như vậy, sinh phẩm để thực hiện XN là không rẻ.
• Xác định đoạn DNA mẫu [template], hay còn gọi là đoạn DNA “Nền”: Đoạn DNA này chính là 1 đoạn DNA của virus chứa các thông tin cần nghiên cứu để nhân bản.
• Đoạn DNA “Mồi” [polymers]: Là những đoạn DNA nhân tạo có thể gắn khoảng 18 - 25 Nucleotids, được xác định từ đoạn đầu đến đoạn cuối tương ứng với đoạn mẫu [template] cần nhân bản để nghiện cứu. Dưới tác dụng của enzym DNA polymerase, các Dexoxynucleotid [vật liệu di truyền] sẽ được gắn lên đoạn “mồi” một cách chính xác và đặc hiệu theo đúng đoạn mẫu để có 1 cặp DNA hoàn chỉnh mới. Từ cặp DNA nhân bản này, đến lượt chúng lại được tách ra và tiếp tục nhân lên theo cấp số nhân để thành vô số các phiên bản khác.
• Cuối cùng DNA khuyếch đại được phát hiện bằng 2 phương pháp: Hoặc “Sắc ký gel Agarose”, người ta nhỏ mẫu PCR vào gel Agarose và chạy điện di trên gel, rồi quan sát các đoạn DNA di chuyển từ cực [-] đến cực [+]. Kết quả được so sánh với thang DNA mẫu có sẵn. Hoặc nhuộm bằng Ethidium Bromide. Đây chính là phương pháp PCR cổ điển [clasical PCR]
• So với tiêu chuẩn “Vàng” - Nuôi cấy, phân lập và định danh virus, PCR cổ điển có độ nhạy là 90,4% và độ đặc hiệu là 94%.

    b] Nguyên lý của xét nghiệm RT - PCR:
Người ta dễ nhầm “RT” - Real Time với “RT” - Reverse Transcriptase, là quá trình tổng hợp chuỗi đơn DNA từ khuôn mẫu RNA của virus Đây là 2 kỹ thuật hoàn toàn khác biệt nhau. Đối với virus họ Corona nói chung và   SARS - CoV- 2 nói riêng do có bộ mã di truyền là RNA, nên phản ứng xác định Corona virus gọi đầy đủ phải là Real Time - Reverse Transcriptase PCR [Real Time - RT - PCR].
    c] Nguyên lý của xét nghiệm Real time - RT - PCR: 
Real Time PCR - PCR thời gian thực, bản thân chữ “Real time” chỉ đúng với các chủng có bộ mã di truyền là DNA: Với kỹ thuật này DNA  khuếch đại được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt, kết quả sẽ được thể hiện trên biểu đồ khuếch đại [Amplication Graph] có trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích và trục hoành là chu kỳ nhiệt: Tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng phân tử DNA được nhân bản trong phản ứng, khi tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy RT - PCR thu nhận và xử lý. Và khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của “Mẫu” vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang của “Nền” thì mẫu đó được xác định là [+] và người ta lấy thời điểm 2 đường cắt nhau đó: So sánh giá trị chu kỳ ngưỡng Ct với đường cong chuẩn được xác định trước để suy ra nồng độ phân tử DNA đích trong mẫu thử ban đầu. Khi phân tích đường biểu diễn này chúng ta chú ý khái niệm: Ct [Chu kỳ ngưỡng - Threshold Cycle] và Cb [Chu kỳ nền - Basal Cycle] vì nó liên quan đến kỹ thuật bên dưới. Với RT - PCR để xác định chính xác bản đích ban đầu người ta cần làm RT - PCR “mẫu Thử” và RT - PCR “mẫu Chuẩn” [do KTV pha loãng dần theo hệ số Logarit 10], vì vậy sẽ sai lầm và thiếu hiểu biết nếu nhà Sản xuất bộ thuốc thử RT - PCR nào lại cung cấp sẵn các PCR mix để lượng chuẩn DNA đích, công việc này phải do Kỹ thuật viên xét nghiệm tự pha loãng các nồng độ chuẩn để cho vào RT - PCR mix.

   d] Nhược điểm của phương pháp Real Time RT – PCR

• Giá thành cao [trang thiết bị, hóa chất và sinh phẩm sử dụng cho XN]
• Quy trình xét XN SARS - COVI - 2 gồm nhiều công đoạn từ khi lấy mẫu đến khi máy cho ra kết quả [trong đó có những công đoạn do chính KTV trực tiếp làm - yếu tố chủ quan, nên khó để thực hiện chuẩn].
• Nhân lực thực hiện phải được đào tạo chính quy và nhất là phải có kinh nghiệm.

   4. Kết quả XN RT - RT - PCR tại VN phụ thuộc yếu tố nào?

• DỤNG CỤ LẤY BỆNH PHẨM: Que lấy mẫu phải là dụng cụ chuyên dụng, cán que phải mỏng mềm để trách tối đa kích thích khi lấy mẫu [khiến NB ho hoặc hắt hơi, văng giọt bắn ra xung quanh], phải đủ dài để đưa tới vùng Tỵ - Hầu. Chất liệu đầu que lấy mẫu phải là nylon hoặc bọt xốp, tuyệt đối không sử dụng bông gòn [bản chất hữu cơ] vì sẽ gây ức chế phản ứng hoặc làm nhiễu kết quả XN. Trong thời gian đỉnh của dịch tại Ý, mặc dù Chính phủ Ý thực hiện phong tỏa phần lớn các xí nghiệp trên phạm vi toàn quốc, nhưng vẫn đặc cách cấp phép cho Cty Copan Diagnostics Inc để sản xuất que lấy mẫu bệnh phẩm. Còn ở Mỹ, Cty Puritan Medical Products hoạt động hết công suất nhưng vẫn không cung ứng đủ que lấy mẫu bệnh phẩm cho nhu cầu thị trường, buộc nhà cung cấp này phải tăng giá lên gấp 10 lần nhưng vẫn tiêu thụ hết. Việc sử dụng que cứng và bông gòn lấy mẫu như 1 số nơi ở Việt Nam, chắc chắn đây là 1 điểm yếu đầu tiên làm sai lệch kết quả.

• VỊ TRÍ LẤY MẪU: Là vùng Tỵ - Hầu [là nơi gấp khúc của đường thở], que lấy mẫu phải được đưa qua đường mũi đến sát lỗ vòi Eustache [H.2] là nơi có xác suất lấy được bệnh phẩm Virus cao nhất ở đường hô hấp trên. Theo 1 nghiên cứu: Tỷ lệ lấy được bệnh phẩm ở những người nhiễm Virus như sau [Dịch rửa phế quản 93%, Đờm 72%, Dịch Ty-Hầu 63%, Dịch hầu họng 32 %, Phân 29%]. 

•  MÔI TRƯỜNG LẤY MẪU: Lý tưởng là lấy mẫu từng người trong phòng lưu thông gió 1 chiều, tốt nhất là phòng có áp lực âm. Không nên lấy mẫu cho nhiều người  cùng 1 lúc trong không gian chung. Vì trong quá trình lấy mẫu người bệnh phải bỏ khẩu trang, khi người bệnh nào đó ho hoặc hắt hơi do bị kích thích bởi dụng cụ lấy mẫu thì có thể: Một là lây chéo cho NB khác khi đó đã bỏ khẩu trang, hai là gây [+] giả cho người khác nếu giọt bắn của người [+] bám vào que lấy mẫu của người ko mắc bệnh khi nhân viên y tế đang thao tác.
• VẬN CHUYỂN MẪU: Khi dung dịch chứa bệnh phẩm được chuyển đến phòng Thí nghiệm [đặc biệt trong trường hợp nhiều bệnh phẩm được chuyển đến cùng 1 lúc], các nhân viên XN được trang bị đồ phòng hộ sẽ chuyển từng mẫu bệnh phẩm vào 1 hộp thủy tinh an toàn sinh học có thiết bị kiểm soát luồng không khí để làm XN. Việc làm này tưởng đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ năng chính xác tỉ mỉ, tinh thần làm việc tập trung và có trách nhiệm cao nếu ko sẽ cực kỳ nguy hiểm khi để Virus phát tán ra ngoài môi trường hoặc lây chéo từ mẫu của người này sang mẫu của người khác.
• BỘ SINH PHẨM ĐỂ LÀM XÉT NGHIỆM: Để có độ chính xác cao của XN cần phải sử dụng bộ sinh phẩm chất lượng cao, đương nhiên đi theo nó giá thành sẽ cao. 
• NĂNG LỰC CỦA NHÂN VIÊN XÉT NGHIỆM: Phải đảm bảo 2 phẩm chất [đào tạo chính quy và có kinh nghiệm], tình trạng các Kỹ thuật viên XN có kinh nghiệm đang khan hiếm ngay ở nhiều quốc gia phát triển. Ví dụ trong quá trình Kỹ thuật viên thực hiện không thay pipette sau mỗi lần lấy mẫu từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp, nồng độ cao còn bám trên thành pipette làm sai lệch nồng độ kế tiếp, khiến sự chênh lệch nồng độ của các mẫu ngắn lại, Ct các mẫu sẽ gần nhau hơn. Hoặc khi pha loãng mà không lấy đủ thể tích làm chênh lệch nồng độ các mẫu tăng lên, Ct các mẫu sẽ xa nhau hơn ...

Vậy những người nào cần làm XN:

      -    Những người có triệu chứng của bệnh Covid-19, kể cả những người đã tiêm chủng hay chưa hoặc đã từng bị nhiễm virus hay chưa.
      -    Những người tiếp xúc gần người được xác nhận nhiễm Covid - 19 trong khoảng 2 m trở lại, kéo dài 15 phút trở lên, trong vòng 24 h.
      -    Những người tham gia vào các hoạt động có nguy cơ cao mà ko giữ được khoảng cách > 2m như đi du lịch, hội họp, hoặc tập trung nhiều người trong 1 không gian hẹp, hoặc di             chuyển trong các phương tiện giao thông công cộng.
      -    Nhân viên y tế làm việc trong các BV hoặc những người tham gia công tác phòng chống dịch.
Hiện nay chúng ta chưa có số liệu chính xác tỷ lệ [-] giả là bao nhiêu vì số lượng XN của Việt Nam còn rất khiêm tốn, nhưng gần như chắc chắc ko phải nhỏ vì 2 lý do: Xét nghiệm làm bằng máy nhưng có những công đoạn do yếu tố chủ quan của con người can thiệp [như đã phân tích ở trên]/Virus chủ yếu ở trong phổi [93%], trong Mũi - Họng chỉ có từ 32% - 63%. Vì vậy chúng ta vẫn phải trung thành với nguyên tắc: Nâng cao TRÁCH NHỆM với bản thân mình, với gia đình, với cộng đồng bằng các biện pháp tưởng rất ĐƠN GIẢN nhưng thực sự HIỆU QUẢ [Mang khẩu trang, Rửa tay, Hạn chế những tiếp xúc/giao tiếp không cần thiết, Tuân thủ nghiêm quy định tự cách ly tại nhà khi nhiễm bệnh không triệu chứng/hoặc trong khu vực bị phong tỏa và Nhắc nhở mọi người cùng thực hiện].