Sự ra đời của phương pháp xét nghiệm PCR là bước tiến mới của nền y học hiện đại. Phương pháp này hiện đã được ứng dụng rộng rãi trong y học, dùng để chẩn đoán những bệnh đặc hiệu mà xét nghiệm truyền thống không làm được.
1. Xét nghiệm PCR là gì?
PCR [Polymerase Chain Reaction gọi là phản ứng chuỗi polymerase] là một kỹ thuật được phát minh vào năm 1985 bởi một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis. Phát minh này được coi là một cuộc cách mạng lớn đối với nền y học thế giới, và đã được trao giải thưởng danh giá Nobel vào năm 1993.
Phương pháp xét nghiệm PCR có thể nhân bản một lượng lớn lên đến hàng triệu bản ADN nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng.
Nguyên lý hoạt động của PCR là nhằm tạo ra một lượng lớn các bản sao ADN từ một đoạn ADN chọn lọc chỉ trong một thời gian ngắn. Sự sao chép ADN được diễn ra trong môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào.
Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào,… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng.
Đặc biệt, phương pháp PCR có độ nhạy đặc nhạy lên tới 90,4% và độ đặc hiệu là 94% khi so sánh với phương pháp nuôi cấy [tiêu chuẩn vàng].
Như vậy, xét nghiệm PCR cho kết quả chính xác cao hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống. Nó có thể giúp phát hiện ra nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và tiết kiệm được nhiều thời gian hơn.
2. Xét nghiệm PCR chẩn đoán những bệnh gì?
Ngày nay, xét nghiệm PCR được ứng dụng rộng rãi trong y học. Xét nghiệm PCR thường được dùng để chẩn đoán những bệnh đặc hiệu, liên quan đến các loại virus mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được. Cụ thể xét nghiệm PCR giúp chẩn đoán chính xác các bệnh như:
- Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh như các virus [viêm gan B, viêm gan C, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…].
- Phát hiện các vi khuẩn lậu [Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…].
- Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.
- Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư [tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…]
Xét nghiệm PCR có thể phát hiện được virus HPV với độ chính xác cao.
- Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người [HLA, human lymphocyte antigen]…
- Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus – MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase…]
Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…
3. Xét nghiệm PCR bao nhiêu tiền?
Xét nghiệm PCR thường có giá thành cao bởi những hoá chất để làm phản ứng đều phải nhập ngoại. Đó là chưa kể đến những máy móc thiết bị xét nghiệm PCR cũng có giá thành lên tới hàng chục ngàn USD. Thông thường, để xét nghiệm một bệnh phẩm bằng phương pháp PCR, người bệnh phải tiêu tốn tối thiểu 8 - 10 USD/ lần xét nghiệm.
4. Những ưu – nhược điểm của xét nghiệm PCR.
4.1. Ưu điểm
Phương pháp xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm truyền thống như:
- Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm.
- Phát hiện được các tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm lâm sàng không có khả năng phát hiện với các xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống như các tác nhân virus [HCV, HBV, HPV…], tác nhân vi sinh không thể triển khai nuôi cấy được tại phòng thí nghiệm lâm sàng vì khả năng gây dịch cao [H5N1] hay khó nuôi cấy [C. trachomatis, L.pneumophila], hay có mặt rất ít trong bệnh phẩm [ tuberculosis trong lao ngoài phổi, tác nhân viêm màng não mủ cụt đầu…], hay là các tác nhân có thể nuôi cấy được nhưng thời gian có kết quả chung cuộc quá lâu [M. tuberculosis].
- Xét nghiệm PCR còn có thể cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/ 1 ml máu. Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiên lượng giai đoạn bệnh.
- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác...nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh.
- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau.
4.2. Nhược điểm
- Xét nghiệm PCR rất khó thực hiện được một cách chuẩn mực tại các phòng thí nghiệm lâm sàng.
- Giá thành khá cao.
- Đòi hỏi trình độ của kỹ thuật viên, bác sĩ phải là người có trình độ cao.
- Đòi hỏi trang thiết bị , máy móc kỹ thuật hiện đại.
Xét nghiệm PCR là kỹ thuật phức tạp, hỏi nhân viên kỹ thuật, bác sĩ phải giàu kinh nghiệm, có trình độ cao.
5. Xét nghiệm PCR ở đâu nhanh và chính xác nhất?
Xét nghiệm PCR là kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi trang bị hiện đại, đồng thời với độ nhạy phản ứng rất cao đòi hỏi nhân viên kỹ thuật, bác sĩ phải giàu kinh nghiệm, có trình độ cao, tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật để tránh hiện tượng dương tính giả khi bị nhiễm lại sản phẩm PCR. Do những yêu cầu cao như vậy nên không phải ở bất cứ bệnh viện nào cũng có thể tiến hành làm xét nghiệm PCR được.
Do đòi hỏi trang thiết bị hiện đại nên không phải bệnh viện nào cũng có thể làm xét nghiệm PCR.
Hiện nay, tại Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC đang sử dụng phương pháp realtime PCR [là một cải tiến kỹ thuật cao hơn của phương pháp PCR] để giúp nâng cao hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị các loại bệnh lý nói chung. Với công nghệ đầu dò Taqman [Taqman probe] cùng chứng nội tại [Internal control] được cho vào ngay từ quá trình tách chiết cho phép kiểm soát toàn bộ quá trình xét nghiệm từ đó cho ra kết quả nhanh chóng và chính xác hơn. Bệnh nhân sẽ nhận được kết quả xét nghiệm PCR chỉ sau vài giờ đồng hồ, tiết kiệm được rất nhiều thời gian và chi phí khi thăm khám, đi lại.
Hy vọng qua những thông tin hữu ích trong bài viết trên, bạn đã có cái nhìn tổng quan hơn về phương pháp xét nghiệm PCR, những ưu điểm và hạn chế của phương pháp này cùng những địa chỉ làm xét nghiệm chính xác, uy tín nhất hiện nay.
Realtime PCR là gì?
Tương tự như PCR [nếu chưa rõ về PCR có thể nhấp vào đây], realtime PCR cũng là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt. Tuy nhiên, trong kỹ thuật PCR cần phải đợi PCR hoàn tất [end-point] mới tiếp tục sử dụng một số kỹ thuật khác, chẳng hạn như điện di sản phẩm PCR trên gel agarose mới có thể xác định sự hiện diện của trình tự khuếch đại. Còn trong kỹ thuật realtime PCR thì tín hiệu khuếch đại sẽ được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó mà người thực hiện có thể theo dõi được kết quả PCR mà không cần đợi đến khi hoàn tất, cũng như không cần phải thực hiện thêm một số kỹ thuật khác.
Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR
Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR có trục tung [Y] là cường độ tín hiệu huỳnh quang đo được từ phản ứng PCR, còn trục hoành [X] là số chu kỳ nhiệt [Hình 1]. Trong các chu kỳ đầu, tín hiệu huỳnh quang phát ra chưa đủ mạnh để máy có thể đo được, đường tín hiệu sẽ nằm ngang [gọi là tín hiệu nền]. Khi số bản sao DNA đủ lớn, máy sẽ bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra, và tín hiệu lúc này sẽ tăng lên sau mỗi chu kỳ nhiệt, giai đoạn này gọi là giai đoạn lũy thừa [log phase]. Đến một chu kỳ nào đó, phản ứng cạn kiệt nguyên liệu và enzyme Taq polymerase cũng không hoạt động hiệu quả nữa dẫn đến tín hiệu sẽ không tiếp tục gia tăng, giai đoạn này gọi là giai đoạn bình nguyên.
Hình 1. Biểu đồ khuếch đại của một quy trình realtime PCR
Trên biểu đồ khuếch đại [Hình 1] có một thông số rất quan trọng đó là chu kỳ ngưỡng [Ct], đây là chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR bắt đầu vượt qua đường tín hiệu nền. Trong phản ứng realtime PCR, tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu mà Ct sẽ xuất hiện sớm hay muộn. Mẫu ban đầu nhiều thì Ct sẽ xuất hiện sớm và ngược lại, mẫu ban đầu ít thì Ct sẽ xuất hiện muộn.
Đường chuẩn của realtime PCR
Khi đem một mẫu chuẩn có hàm lượng DNA đã xác định đi pha loãng bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tất cả các nồng độ pha loãng đi chạy realtime PCR ta sẽ được các giá trị chu kỳ ngưỡng Ct khác nhau. Đường biểu diễn mối liên hệ giữa Ct và hàm lượng DNA được gọi là đường chuẩn realtime PCR [Hình 2], trên đường chuẩn sẽ có 2 thông số quan trọng cần quan tâm:
- 1] Hệ số tương quan R2 đánh giá độ chính xác của thao tác pipette, hệ số R2 càng gần giá trị 1 thì thao tác càng chính xác. Thông thường giá trị R2 ≥ 0.99.
- 2] Hiệu quả khuếch đại E, trong điều kiện lý tưởng giá trị E = 100%, tuy nhiên trong thực tế thì giá trị E chấp nhận được ở mức 90 - 105%.
Dựa vào đường chuẩn và giá trị Ct của mẫu đầu vào, ta có thể định lượng chính xác hàm lượng DNA bên trong mẫu. Đây là ưu điểm vượt trội của realtime PCR khi so sánh với PCR, do trong kỹ thuật PCR thì tín hiệu được quan sát lúc phản ứng đã kết thúc nên cường độ tín hiệu không còn phản ánh tương quan chính xác với lượng DNA đầu vào nên không thể sử dụng cho định lượng.
Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan
Trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Bài viết lần này sẽ giới thiệu về cách dựa trên mẫu dò TaqMan, đây là một loại mẫu dò [probe] được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật realtime PCR. Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan gần như tương đồng với một phản ứng PCR thông thường, ngoại trừ việc trong thành phần có chứa thêm mẫu dò TaqMan.
Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24 - 30bp với đầu 5' gắn một chất phát huỳnh quang [reporter] và đầu 3' còn lại gắn chất hấp thụ [quencher]. Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5' - 3' exonuclease [Hình 3], reporter được giải phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu [xem video bên dưới].
Mồi trong phản ứng realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 - 60 oC và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 - 10 oC để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước. Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra tối ưu nhất.
Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có 2 giai đoạn:
- 1] Biến tính ở 94 - 95 oC trong 15 - 30 giây.
- 2] Bắt cặp và kéo dài ở 60 oC trong 30 - 60 giây.
Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR
1] Định lượng trình tự đích trong mẫu:
- - Định lượng tuyệt đối: Sử dụng đường chuẩn realtime PCR và Ct của mẫu có thể tính được hàm lượng DNA trong mẫu [theo đơn vị số copy hoặc ng].
- - Định lượng tương đối: Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau, mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích cao hơn. Tuy nhiên trong thực tế thì không có bằng chứng nào để khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene chứng nội [IC], việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC. Đó là nguyên lý của phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt của Livak [xem thêm TẠI ĐÂY].
2] Định tính trình tự đích trong mẫu: Giống như PCR, realtime-PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, .... ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn [SNP], ...
Các vấn đề thường gặp trong xét nghiệm bằng realtime PCR
1] Ngoại nhiễm sản phẩm PCR: Khi thực hiện realtime PCR nhiều lần thì môi trường xung quanh và hóa chất, dụng cụ, ... cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm khuếch đại, do đó cũng cần khắc phục bằng dUTP kết hợp với enzyme UNG [xem thêm TẠI ĐÂY]. Đồng thời luôn chạy kèm 1 mẫu chứng âm [sử dụng nước thay cho mẫu] để đánh giá tình trạng ngoại nhiễm.
2] Âm tính giả: Phản ứng realtime PCR có thể bị ức chế bởi các hóa chất, các thành phần khác có trong mẫu. Vì vậy cần có 1 mẫu chứng dương và các mẫu phản ứng nên chạy duplex PCR [target và IC] để đảm bảo âm tính không do các thành phần khác gây ra.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phạm Hùng Vân. PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các ứng dụng thường gặp.