Công nghệ DNA tái tổ hợp
1. Định nghĩa
- Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kĩ thuật phân tử để định vị,
phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA
Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm các mạng lưới các kỹ thuật phân tử
được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA
2. Các công cụ chính của kỹ thuật tạo dòng DNA tái tổ hợp
- Các enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn [restriction endonuclease] hay gọi tắt là enzyme giới
hạn [restrictase] là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự
nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung
tại các vị trí đặc thù.
Tính từ lần đầu phát hiện cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã
tìm ra và tách chiết được hàng trăm loại enzyme cắt giới hạn khác. Xét
theo những đặc tính sinh học đặc trưng như: điểm cắt, khả năng methyl
hóa, điều kiện để cắt và cấu trúc, người ta chia các enzyme cắt giới hạn
thành 3 loại khác nhau, đó là:
Enzyme cắt giới hạn loại 1: Chúng có cấu trúc bao gồm 3 chuỗi
polypeptide khác nhau. Điểm cắt của các enzyme loại này sẽ nằm ở vị trí
cách xa trình tự nhận biết [khoảng cách thường trên 1000bp]. Chúng có
khả năng methyl hóa gốc Adenin và điều kiện để xảy ra phản ứng cắt là có
năng lượng ATP, Mg2+ và S-AdoMet.
Enzyme cắt giới hạn loại 2: có cấu trúc bao gồm 2 chuỗi polypeptide
giống nhau. Vị trí cắt trên mạch ADN của các enzyme giới hạn này nằm ở
trong trình tự nhận biết. Chúng không có khả năng methyl hóa gốc Adenin
và điều kiện để xảy ra phản ứng cắt là chỉ cần có Mg2+ hoặc Mn2+.
Enzyme cắt giới hạn loại 3: có cấu trúc bao gồm 2 chuỗi polypeptide
khác nhau. Điểm cắt trên mạch AND của các enzyme loại này nằm ở bên
ngoài trình tự nhận biết nhưng gần hơn nhiều so với enzyme loại 1. Chúng
DNA là chữ viết tắt của axit 2’-deoxyribonucleic, được nhà sinh học người Thụy Điển Miescher tìm ra vào năm 1869 trong nhân tế bào bạch cầu [tế bào mủ]. Đầu tiên ông gọi nó là nuclein có nghĩa là hạch nhân. Sau đó, ông đã phát hiện ra nó có bản chất axit và gọi nó là axit nucleic. Sau hơn 80 năm cùng với sự tranh cãi của nhiều nhà khoa học, đến năm 1952, người ta mới công nhận DNA là vật chất di truyền.
DNA gồm 3 thành phần chính: bazơ nitơ dạng purine và pyrimidine [A,T,C,G], đường pentose [đường 5 carbon] và axit phosphoric [H3PO4]. Ba thành phần này có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạo thành một nucleotide
Cấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra. Đó là chuỗi xoắn kép cong nhẹ nhàng, có cấu trúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song,đối xứng và bổ sung cho nhau theo một qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp với G nhờ các liên kết hydro. Cấu trúc xoắn kép của Watson- Crick là chiếc chìa khóa để mở ra những kỹ thuật của sự sống.
DNA tái tổ hợp
Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các bazơ nitơ, nhiều nhà nghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
Vào những năm 70, bằng những phương pháp khác nhau, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên.
Năm 1972, nhóm nghiên cứu của trường đại học Stranford [Paul-Berg] đã đưa ra phương pháp đuôi để nối các phân tử DNA khác nhau. Để tạo đầu dính, người ta sử dụng enzyme terminal transferase. Dưới tác dụng của enzyme này, người ta đã tạo được những đuôi poly nucleotide khoảng 50 đến 100 gốc adenine [polyA] ở đầu OH [3’] của mạch đơn DNA SV 40 [Simian virus 40] và đuôi polyT ở DNA plasmid đã được mở bởi enzyme. Sau khi trộn lẫn hai loại DNA này, các đuôi bổ sung adinine và thymine bắt cặp lại với nhau và với sự có mặt của enzyme ligase, hai DNA này được nối lại và tạo ra plasmid tái tổ hợp vòng. Vì sự an toàn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổ hợp này không được biến nạp trong tế bào chủ. Tuy chưa hoàn tất, nhưng thực nghiệm của Berg đã cho ta hai vấn đề mấu chốt về DNA tái tổ hợp. Ông cho rằng, có thể dùng enzyme để cắt DNA một cách định trước và các đoạn DNA ở các loài khác nhau có thể nối lại với nhau.
Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã lao vào các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được những kết quả có ứng dụng trong thực tiễn.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA do Rerg, Chang, Boyer và Cohen đề ra đã giúp các nhà sinh học có thể làm thay đổi tính di truyền của cơ thể sống theo chiều hướng định trước và vượt qua được hàng rào ngăn cản loài. Mỗi tổ hợp DNA mới đều tạo nên những đặc điểm sinh học mới kể cả về mặt di truyền lẫn sinh hóa.
Vậy người ta gọi DNA tái tổ hợp là một DNA lai, tìm được invitro [trong ống nghiệm] bằng cách tổ hợp 2 DNA thuộc 2 loài khác nhau.
Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp [Hình dưới].
Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai. Nó chính là một mảnh [đoạn] DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào DNA của plasmid hay DNA của virus.
Mục đích tạo DNA tái tổ hợp
DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ...
Những yêu cầu của DNA tái tổ hợp
- DNA tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen.
- DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ.
- DNA tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn. Và dễ quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp.
Các công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp
Chọn nguyên liệu
DNA được chọn làm phương tiện vận chuyển gen [vector] thường là DNA plasmid và DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, được tách và làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus.
DNA chứa gen cần nghiên cứu [DNA lạ] cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.
Các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme ristriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkanline phosphotase, ...
Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE kiểu II
RE [Restriction Endonuclease] kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg +2 size 12{ {} rSup { size 8{+2} } } {} và không cần năng lượng ATP.
- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA.
Công đoạn nối với sự có mặt của DNA ligase
Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase.
DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’[P] và đầu 3’[OH] của hai nucleotide đứng cạnh nhau [Hình 6-2]. Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau.
Nối đầu bằng
Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’[P] và đầu 3’[OH] được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.
Nối đầu lệch
Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các bazơ nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH[3’] và P[5’] dưới tác dụng của enzyme DNA ligase. Phản ứng nối được thực hiện theo sơ đồ được biểu diễn trên Hình dưới.
Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp
Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch
Chọn và xử lí DNA plasmid
Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II [như EcoRI] cắt để tạo ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau.
Chọn và xử lí đoạn cài
DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid [EcoRI] để tạo ra các vết cắt giống nhau.
Tạo plasmid tái tổ hợp
Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp. Phản ứng nối xảy ra theo sơ đồ được biểu diễn trên Hình dưới.
Phương pháp sử dụng đoạn nối [linker]
Chọn và xử lí vector plasmid:[tương tự như trên]
Chọn và xử lí đoạn cài
Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết bởi một enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là G/AATTC.
cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được nhận biết bởi enzyme EcoRI.
Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai.
Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch
Tạo vector tái tổ hợp
Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành [Hình dưới].
Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase [ETT]
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’[OH] của phân tử DNA.
Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước sau
Bước 1
Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI [G/GATCC].
Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính.
Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch nhau.
Bước 2
Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’[OH] của DNA lạ.
Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’[OH] của plasmid hở.
Bước 3
Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút của homopolymer có trình tự bổ sung [-GGGG 3’/3’CCCC-] sẽ bắt cặp với nhau.
Bước 4
Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI.
Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.
Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ
Hóa biến nạp
Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen, cũng là công cụ để thực hiện các thao tác tạo tính di truyền của vật sống. Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi DNA ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn được xử lí trong môi trường có CaCl 2 size 12{ {} rSub { size 8{2} } } {} và trước đó được sốc nhiệt ở 42°C.
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai buớc sau: Xử lí tế bào chủ trong dung dịch CaCl 2 size 12{ {} rSub { size 8{2} } } {} ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lí.
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn. Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tế bào bằng các ion kim loại hóa trị hai như Mg +2 size 12{ {} rSup { size 8{+2} } } {}, Mn +2 size 12{ {} rSup { size 8{+2} } } {}và Ba +2 size 12{ {} rSup { size 8{+2} } } {} cũng cho khả năng biến nạp lớn.Ngoài ra, hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao.
Điện biến nạp
Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp được dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau,
- Độ dài của hằng số thời gian [thời gian ngắt xung - ms]. Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết đối với các loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt được khoảng 6ms,
- Nồng độ tế bào chủ,
- Nồng độ DNA tái tổ hợp,
- Giai đoạn phát triển của tế bào [tế bào quá già hoặc quá non đều không thích hợp],
- Môi trường dung dịch đệm,
- Cấu trúc màng tế bào.
Biến nạp tế bào trần [protoplast]
Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lí bằng polyetylen glycol [PEG]. Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40%. Đây là phương pháp chuyển gen có hiệu quả cao đối với tế bào thực vật. Bằng phương pháp này, người ta đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ [Potrykus và cộng sự - 1995].
Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao. Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào. Đặc biệt là loại cây có giá trị kinh tế cao như lúa, ngô, đại mạch.
Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây.
Phương pháp bắn gen
Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn trực tiếp vào tế bào.
Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loại tế bào thực vật. Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp khảm [cây có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp].
Một số thành tựu đã đạt được bằng phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc. Cabe và cộng sự đã nhận được cây đậu tương biến nạp đầu tiên bằng phương pháp bắn gen. Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm và cộng sự đã nhận được cây ngô biến nạp ở nhiều phòng thí nghiệm. Những năm gần đây có hàng loạt công bố về biến nạp thành công ở lúa. Năm 1996, Zthang và cộng sự đã biến nạp ở đu đủ, mía và bông. Điều đó đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này.
Phương pháp vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định.
Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử. Tùy thuộc từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn phương pháp sao cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.
Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định đưa DNA vào loại tế bào nào. Đưa chính xác và thậm chí vào tận nhân của tế bào và có thể quan sát được. Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phôi cũng có thể tiến hành một cách chính xác. Có thể biến nạp cho mọi giống cây.
Nhược điểm: Một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo léo và tỉ mỉ.
Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể [Bacteriophage].
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E. Coli qua phage λ, phage P1 và ở Bacillus subtilis qua phage SP10 . So với các phương pháp trên, tải nạp cho hiệu suất cao hơn.
Như vậy, đến nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tùy các đối tượng và yêu cầu cụ thể, phương pháp này hay phương pháp khác có hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.
Kỹ thuật tách dòng [tạo dòng]
Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh [chuỗi] DNA lạ vào một vector [plasmide hoặc phage λ] bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử lai này vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó.
Mục đích của sự tách dòng
- Thiết lập ngân hàng bộ gen,
- Thiết lập ngân hàng cDNA,
- Sản xuất protein, enzyme,
- Sản xuất vaccine,
- Sản xuất kháng sinh.
Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng
Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực hiện các bước sau
Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng
Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế [RE]. Phân lập đoạn DNA [gen quí] phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng.
Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA.
Tạo đầu dính khi cần thiết.
Chọn và xử lí vector
Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ [đoạn cài], loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng.
Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên [để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này]. Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại.
Tạo DNA tái tổ hợp [Vector tái tổ hợp]
Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.
Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D [Doner] sang tế bào thể nhận R [Reception], không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp vi tiêm.
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D [Doner] sang tế bào thể nhận R [Reception] qua nhân tố trung gian là virus. Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid, ...
Phát hiện dòng cần tìm
Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc chọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên theo ba khả năng
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp,
- Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ,
- Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp.
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau để xác định dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn DNA đã biết [cDNA], công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.
Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp
Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp. Nếu là mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme RE loại II và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung vector, còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cDNA. Cách kiểm tra lại cDNA đã được cắt bằng cách điện di trên gel agaroza 0,8% và kiểm tra lại độ dài của những băng cDNA thu được. Những đoạn có kích thước khác nhau sẽ di chuyển những khoảng cách khác nhau trên gel.
Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh,... người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.
Một số phương pháp xác định dòng cần tìm
Phương pháp lai axit nucleic
Khái niệm đầu dò
Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa.
Đặc điểm của đầu dò
Là một đoạn axit nucleic [DNA hoặc RNA] sợi đơn. Đầu dò phải bổ sung các bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ.
Các loại đầu dò
cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide cũng có thể làm đầu dò. Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với DNA đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đầu dò. Còn nếu một phần DNA phải so mốc đã biết thì công việc rất dễ dàng để tổng hợp một đầu dò.
Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic
Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA. Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ sinh lý [thường ở khoảng 80 đến 95°C], hai sợi đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự bắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tính đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình tự DNA và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai.
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu [đầu] dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA.
Phương pháp sử dụng kháng thể
Nguyên tắc
Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa.
Cách tiến hành
Chọn kháng thể đặc trưng cho protein [thuốc thử cho protein]. Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể.
Ứng dụng
Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là vector biểu hiện [ví dụ như vector λgt11]. Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng.
Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn
Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.
Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR 322 size 12{ {} rSub { size 8{"322"} } } {} . Trong plasmid pBR 322 size 12{"322"} {} có hai gen kháng thuốc AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng.
Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai.
Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình
Nguyên tắc
Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc đó có chứa gen lạ.
Cách tiến hành
Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa gen lacZ [ví dụ như dãy pUC], một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal [5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside]. Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X [dẫn xuất indol], ngoài môi trường, dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm.
Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase. Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.
Ngân hàng gen
Ngân hàng bộ gen của một sinh vật là tập hợp các trình tự DNA cấu thành bộ gen được gắn vào vector, nó chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngân hàng này được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tái tổ hợp cả các chuỗi mã hóa lẫn các chuỗi không mã hóa. Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng bộ gen có thể được thiết lập bất kỳ loại tế bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập ngân hàng gen:
- Tách và làm sạch DNA của sinh vật,
- Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng enzyme RE loại II - thông thường, người ta sử dụng EcoRI,
- Vector được chọn để tạo dòng gen thường là cosmid hoặc phage λ cũng được xử lý bởi EcoRI,
- Tạo vector tái tổ hợp và đóng gói trong vỏ phage,
- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và tạo dòng,
- Xác định đặc tính và biểu hiện của dòng vi khuẩn vừa lập,
- Tiến hành sàng lọc, nghĩa là phải tách những vector nào có đoạn DNA ưa chuộng, từ đó xây dựng ngân hàng bộ gen.
Đặc điểm và ứng dụng:
- Ngân hàng gen chứa các đoạn DNA lớn hơn 100 lần so với cDNA.
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron và exon của một gen xác định.
- Tạo dòng những trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh các gen mã hóa và đóng vai trò quyết định trong sự điều hòa biểu hiện của gen.
Ngân hàng cDNA
Thiết kế ngân hàng cDNA
Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định [tế bào biệt hóa], vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao.
Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây:
- Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn những tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó, làm sạch mRNA,
- Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A [polyA] bằng cách tách trên cột xenlulose oligo dT,
- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman,
- Metyl hóa các vùng hạn chế [có trong đoạn cDNA sợi đôi] được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI,
- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn [do được metyl hóa]. Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp,
- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat,
- Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp,
- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng,
- Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA.
Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống.
Khi phân tích kết quả thu được ngân hàng cDNA, cần chú ý tác dụng sinh lí từng thời điểm thí nghiệm.
Sàng lọc ngân hàng cDNA
Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA được bắt đầu từ việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro- xenlulose [màng lai] sẽ bị biến tính và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA khác nhau sẽ được lai trên nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung của nó. Các mRNA bám vào màng lọc được tách ra và dùng để tổng hợp protein mà nó mã hóa bằng hệ thống dịch mã invitro. Protein hình thành được đem phân tích xem có phải là sản phẩm của mRNA cần tìm hay không, và từ đó, xác định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn. Sàng lọc tất cả các mẻ nuôi cấy theo cách trên để xác định dòng đơn thể hiện gen tìm kiếm.
Công nghệ tái tổ hợp là gì?
Công nghệ DNA tái tổ hợp là công nghệ tạo ra các phân tử DNA từ 2 hay nhiều nguồn DNA khác nhau, các phân tử DNA được tạo ra mang các đặc tính của các phân tử DNA cấu thành.
Công nghệ protein tái tổ hợp là gì?
Protein tái tổ hợp [protein ngoại lai] là protein tự nhiên được cải biến bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng cao hoặc thay đổi hoạt tính của chúng. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp.
Thế nào là ADN tái tổ hợp?
DNA tái tổ hợp[viết tắt là rDNA] là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng.
Việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme mang lại những lợi ích gì?
Công nghệ DNA tái tổ hợp Đưa các thông tin di truyền ngoại lai vào trong cơ thể vi sinh vật, các tế bào động vật và thực vật sinh trưởng nhanh. Nhờ đó có thể sản xuất ra các sản phẩm của gen ngoại lai [các protein] với các tốc độ và hiệu suất cao hơn mà thường khó có thể thực hiện được ở các hệ thống tế bào khác.