Nguyên nhân phổ biến nhất gây ra lỗi khi sử dụng máy đếm tế bào tự động là gì?

Bạn đã bao giờ lặp lại số lượng ô của mình chỉ để nhận được kết quả rất khác ở lần thứ hai chưa?

Trong tất cả các lĩnh vực khoa học, 'độ chính xác' (hoặc độ lặp lại) có thể thực hiện hoặc phá vỡ các thí nghiệm. Thật không may, việc đếm ô thủ công đặc biệt dễ xảy ra lỗi ngẫu nhiên và kết quả là thường có độ chính xác thấp. Nhưng nếu bạn thấy mình đặt câu hỏi về độ chính xác của kết quả, đừng hoảng sợ;

Trong bài đăng trên blog này, chúng tôi bao gồm

Làm thế nào để chúng tôi đo lường độ chính xác trong đếm tế bào?

Nếu bạn không chắc liệu số lượng ô của mình có chính xác hay không, bạn có thể kiểm tra độ chính xác của chúng bằng cách lặp lại các phép đo và tính toán độ lệch chuẩn (σ) và hệ số biến thiên (CV) của kết quả của bạn

Bạn có thể tính toán độ lệch chuẩn của mình, độ lệch này cho thấy mức độ phân tán của các kết quả xung quanh giá trị trung bình, bằng cách sử dụng công thức sau. 1

GHI CHÚ. x = tổng số ô riêng lẻ, x̅ = giá trị trung bình của tất cả các giá trị, n = kích thước của quần thể

Độ lệch chuẩn thấp cho thấy rằng số lượng ô của bạn không thay đổi nhiều so với giá trị trung bình. e. , bạn đã lặp đi lặp lại số lượng ô nhất quán, cho thấy độ chính xác cao

Khi bạn đã xác định độ lệch chuẩn của kết quả, bạn cũng có thể tính CV. Đây là tham số phổ biến nhất được sử dụng để biểu thị độ chính xác của số lượng ô và nó thường được biểu thị bằng phần trăm. Bạn có thể tính CV bằng công thức sau

Bộ đếm tế bào thủ công có kinh nghiệm thường nhắm đến CV trong khoảng 5 – 15%. Nếu CV của bạn cao hơn nhiều, bạn có thể muốn điều tra cách bạn có thể cải thiện quy trình đếm tế bào và tăng độ chính xác của mình

Hướng dẫn từng bước để xác thực số lượng tế bào của bạn

Nếu bạn vẫn còn nghi ngờ về số lượng tế bào của mình hoặc bạn đang làm việc trong môi trường thực hành sản xuất tốt (GMP), bạn cần xác thực các quy trình của mình. Xác thực cho thấy các quy trình của bạn chính xác, chính xác và mạnh mẽ như thế nào và chứng minh phương pháp của bạn phù hợp với mục đích. Nó thường liên quan đến việc tiến hành nhiều thử nghiệm, bao gồm cả nghiên cứu tuyến tính, để điều tra độ chính xác của bạn trên một loạt nồng độ

Nếu bạn muốn tìm hiểu thêm về cách xác thực các phương pháp đếm ô của mình, hãy xem hội thảo trên web của chúng tôi 'Số lượng ô của bạn chính xác đến mức nào?. Hướng dẫn Xác thực Phương pháp Đếm Tế bào'

Các nguồn gây lỗi chính trong đếm ô thủ công là gì?

Đếm tế bào thủ công bằng máy đo huyết áp thường dễ bị lỗi. Sai số điển hình có thể cao tới 20 – 30%2 và độ chính xác thấp là một trong những nhược điểm chính của việc sử dụng máy đo huyết áp. Xác định nguồn lỗi nào đang ảnh hưởng đến kết quả của bạn là bước đầu tiên để tăng độ chính xác và giảm CV của bạn

Chúng tôi phác thảo bốn yếu tố chính ảnh hưởng đến độ chính xác của việc đếm tế bào bên dưới

1. Lỗi của con người trong quá trình chuẩn bị mẫu

Giống như tất cả các quy trình dựa vào việc chuẩn bị thủ công, việc đếm tế bào bằng máy đo huyết áp dễ bị lỗi do con người từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm cả việc sử dụng pipet không chính xác, lỗi pha loãng và trộn kém. 3

Lỗi cũng có thể phát sinh do làm quá tải các buồng đo huyết áp. Mặc dù máy đo huyết áp có một thể tích cố định, khoảng cách giữa buồng đếm và kính che có thể tăng nhẹ nếu bạn đổ đầy chất lỏng vào buồng đếm. Việc sạc quá nhiều buồng đếm dẫn đến đánh giá thấp thể tích mẫu và đánh giá quá cao nồng độ tế bào của bạn

2. Tính chủ quan trong quá trình kiểm đếm

Việc phân biệt giữa các tế bào và mảnh vụn hoặc các hạt khác có thể khó khăn, ngay cả đối với con mắt tinh tường. Nếu bạn không thể phân biệt dễ dàng giữa tế bào và mảnh vụn, số lượng tế bào của bạn có thể cao một cách giả tạo

Cũng có thể là một thách thức để biết liệu một ô nằm trong hay ngoài lưới đếm. Do đó, việc đếm ô thủ công có thể mang tính chủ quan và số đếm cuối cùng có thể phụ thuộc vào người vận hành. Một ấn phẩm gần đây của Manzini et al. cho thấy rằng ngay cả khi những người vận hành có kinh nghiệm cao trong việc đếm ô, sự khác biệt giữa các người vận hành có thể lên tới gần 20%. 4

3. Sự không nhất quán trong nhuộm tế bào

Trypan blue là một trong những thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi nhất trong đếm tế bào thủ công. Nó là thuốc nhuộm không thấm qua màng, chỉ nhuộm các tế bào không khả thi với màng tế bào bị hư hỏng. Tuy nhiên, trypan blue không nhuộm màu các tế bào một cách đồng đều. Điều này gây ra sự không nhất quán về số lượng tế bào vì có thể khó phân biệt các tế bào không khả thi được nhuộm màu nhẹ với các tế bào khả thi

Trypan blue cũng gây độc cho tế bào, vì vậy số lượng tế bào chết của bạn có thể cao hơn nếu bạn để nhiều thời gian hơn giữa nhuộm và đếm. Hơn nữa, vì trypan blue là một loại muối nên nó có thể gây ra những thay đổi trong quá trình điều hòa thẩm thấu của tế bào, điều này có thể làm cho các tế bào vỡ ra, làm giảm tổng số tế bào chết và tổng số tế bào chết một cách giả tạo, đồng thời dẫn đến đánh giá quá cao khả năng nuôi cấy tế bào

Hội thảo trên web này cho bạn biết thêm về cách trypan blue có thể ảnh hưởng đến các tế bào

4. Lỗi tính toán

Đếm tế bào thủ công dựa trên một số tính toán, bao gồm tính toán hệ số pha loãng, tổng số tế bào hoặc nồng độ, khả năng sống sót, độ lệch chuẩn và CV. Như với tất cả các tính toán, có khả năng xảy ra lỗi do con người khi ghi lại dữ liệu hoặc thực hiện phép tính. Các lỗi nghiêm trọng thường dễ xác định nhưng các lỗi nhỏ hơn (chữ số cuối cùng là 1 hay 7?) có thể không được chú ý và ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả cuối cùng của bạn

Cách tăng độ chính xác khi đếm ô

Khi bạn biết lỗi của mình đến từ đâu, bạn có thể bắt đầu giảm hoặc loại bỏ chúng để tăng độ chính xác tổng thể của mình

Làm việc cẩn thận và nhất quán có thể giảm tác động do lỗi của con người. Đặc biệt cẩn thận khi đổ đầy máy đo huyết áp để đảm bảo bạn không đổ đầy buồng

Có thể giảm tác động của tính chủ quan trong quá trình đếm bằng cách tăng số lượng ngăn bạn đếm và thực hiện đếm ô nhân đôi hoặc nhân ba để xác thực kết quả của bạn. Nếu bạn quyết định thực hiện các phép đo lặp lại, hãy đảm bảo rằng bạn lấy một lượng tế bào mới, trộn chúng với thuốc nhuộm bạn đã chọn và nạp lại buồng chứa, thay vì chỉ đếm lại các tế bào hoặc nạp lại buồng của bạn bằng mẫu thứ hai . Điều này sẽ cung cấp cho bạn phép đo lặp lại tiêu biểu nhất

Bạn đếm càng nhiều ô, ảnh hưởng của các lỗi ngẫu nhiên càng nhỏ và kết quả của bạn sẽ càng chính xác hơn. Theo nguyên tắc chung, bạn nên đếm ít nhất 400 tế bào trên mỗi mẫu (để biết thêm thông tin, hãy xem ghi chú kỹ thuật của chúng tôi 'Ảnh hưởng của nồng độ mẫu đối với biến thể đếm tế bào')

Bạn có thể giảm sự khác biệt giữa những người dùng khác nhau bằng cách đồng ý với các quy tắc đếm ô và áp dụng chúng một cách nhất quán. Để biết thêm thông tin về các quy tắc và quy trình đếm ô, hãy xem phần 'Làm lộ bí mật'. Cách đếm tế bào bằng Hemocytometer. ’

Bạn có thể giảm khả năng xảy ra lỗi tính toán bằng cách tự động hóa các phép tính của mình. Ví dụ: bạn có thể sử dụng bảng tính đếm ô có thể tải xuống của chúng tôi để tính toán hệ số pha loãng, tổng số ô, khả năng tồn tại, độ lệch chuẩn và CV. Bằng cách sử dụng trang tính này, bạn có thể loại bỏ các lỗi trong tính toán và bạn sẽ không còn phải lo lắng về việc mình đã nhấn phím '5' hay '6' trên máy tính của mình

Tải xuống công cụ đếm tế bào từ ChemoMetec

Chuyển sang đếm tế bào tự động

Nếu bạn đang gặp vấn đề với độ chính xác của số lượng ô, bạn có thể cân nhắc sử dụng bộ đếm ô tự động. Các quy trình tự động loại bỏ lỗi bằng cách áp dụng các giao thức đếm một cách nhất quán mọi lúc. Hơn nữa, chúng đếm số lượng lớn các ô một cách nhanh chóng, giảm thiểu tác động của các lỗi ngẫu nhiên. Một số máy đếm tự động cũng sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang thay vì xanh lam trypan, loại bỏ các vấn đề liên quan đến nhuộm màu không nhất quán và độc tính

Các biểu đồ dưới đây cho thấy độ chính xác của việc đếm thủ công so với. đếm tự động ở một loạt nồng độ tế bào. Đồ thị A và B hiển thị CV dưới dạng hàm của nồng độ tế bào đối với A) đếm tế bào tự động bằng cách sử dụng NucleoCounter® NC-202™ và B) đếm tế bào thủ công bằng máy đo huyết áp. 5

Trong biểu đồ A, hầu hết các điểm dữ liệu nằm trên hoặc gần với đường cong phù hợp (giá trị trung bình), cho thấy phương sai thấp và độ chính xác cao. Trong biểu đồ B, các điểm dữ liệu nằm rải rác và chỉ một số ít nằm trên đường cong phù hợp, cho thấy độ chính xác thấp. Hơn nữa, mặc dù cả phương pháp đếm tế bào tự động và thủ công đều cho thấy sự gia tăng CV ở nồng độ tế bào thấp hơn do sự đóng góp gia tăng từ các lỗi ngẫu nhiên, mức tăng thấp hơn khi các tế bào được đếm bằng bộ đếm tự động

So sánh hai biểu đồ cho thấy rõ ràng rằng việc đếm ô tự động mang lại độ chính xác cao hơn so với đếm thủ công. Trên thực tế, việc sử dụng máy đếm tế bào tự động có thể tăng gấp đôi độ chính xác khi đếm tế bào của bạn so với việc sử dụng máy đo huyết áp và đếm tế bào thủ công. 5

Liên hệ với chúng tôi để tìm hiểu thêm về các giải pháp đếm tế bào tự động hoặc đăng ký nhận bản tin của chúng tôi để đảm bảo bạn không bỏ lỡ bài đăng blog tiếp theo của chúng tôi

đọc thêm

Người giới thiệu

BLOG TUYÊN BỐ TRÁCH NHIỆM

Chúng tôi hoan nghênh và khuyến khích người dùng blog để lại nhận xét. ChemoMetec có quyền kiểm duyệt tất cả các nhận xét và xóa bất kỳ nhận xét nào có thể được xác định là i) không liên quan; . Chúng tôi có quyền giữ lại bất kỳ bình luận nào được xuất bản. ChemoMetec không chịu trách nhiệm về nội dung trong các bình luận, nội dung này chỉ thể hiện quan điểm của người bình luận

Các lỗi ảnh hưởng đến bộ đếm tế bào là gì?

Hạn chế lớn nhất của máy đếm tế bào tự động là gì?

Nguồn lỗi trong phương pháp hemocytometer là gì?

Nhược điểm chính của phương pháp đếm tế bào trực tiếp là gì?