Kỹ thuật xử lý mẫu trong kỹ thuật chiết xuất

 Đề tài cấp Bộ : Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định lượng norfloxacin trong dịch sinh học

–    Đề tài đã góp phần phát triển phương pháp nghiên cứu phân tích thuốc trong dịch sinh học nói chung và đối với dược chất norfloxacin nói riêng.
–    Đã xây dựng được phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học tin cậy, đơn giản, phù hợp với hoàn cảnh của phòng thí nghiệm trong nước. Điều đó làm củng cố thêm sự tin cậy vào năng lực nghiên cứu của các cán bộ làm công tác phân tích trong các viện, trung tâm nghiên cứu của Việt Nam.
–    Đề tài đã đề xuất một kỹ thuật thao tác an toàn và phù hợp khi dùng giống chó nhà để khảo sát tương đương sinh học trong quá trình phát triển sản phẩm cũng như áp dụng thử nghiệm khi cần thiết.

b,    Kết quả cụ thể
–    Khảo sát và lựa chọn được 2 kỹ thuật chiết tách norfloxacin từ huyết tương và nước tiểu. Phương pháp chiết tách ổn định, có hiệu suất cao, khả thi.
+ Kết tủa với acid percloric: áp dụng để chiết norfloxacin từ huyết tương. Dùng acid pha loãng 1/10, tỷ lệ huyết tương: acid [4:1], lắc trộn và ly tâm. Lấy dịch nổi để chạy sắc ký. Phương pháp có hiệu suất thu hổi xấp xì 100%. Thời gian chiết nhanh, đơn giản. Tuy nhiên, dịch chiết còn lẫn tạp nên khi sắc ký, áp suất cột thường rất cao nên phải chọn được loại cột thích hợp, và cột nhanh hỏng, có thể bị tắc.
+ Chiết pha rắn: dùng loại cột SPE, khảo sát trên 3 loại cột đều có khả năng chiết tốt, mức độ theo thứ tự: [1] LiChrolut TSC [Mixed mode, 300mg/ 3ml], [2] LiChrolut EN [C18 polymeric Sorbent 2, 200mg/ 3ml] và [3] strata [C18, 200mg/ 3ml]. Phương pháp có thể được áp dụng để xử lý đối với cả mẫu huyết tương và mẫu nước tiểu. Với mẫu huyết tương, nếu sử dụng phương pháp chiết pha rắn, chi phí cao và mất nhiều thời gian hơn. Với mẫu nước tiểu, đây là kỹ thuật xử lý tốt nhất. Mặc dù chi phí cao, nhưng các phương pháp xử lý khác không đáp ứng được yêu cầu.
–    Xây dựng được qui trình định lượng norfloxacin trong dịch sinh học. Phương pháp phân tích đã được thẩm định theo các chỉ tiêu qui định, và đều đáp ứng yêu cầu của dược điển và các tài liệu chuyên ngành. Định lượng norfloxacin trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC với các điều kiện sắc ký
*    Cột: Altima C18, 5|im, 250 X 4mm. Nhiệt độ cột: 40°c.
*    Pha động : MeCN – MeOH – Đệm phosphat pH 3.0 – Acid tricloracetic 0,5%,
tỉ lệ 5 : 18 : 72 : 5 [v/v/v/v].
*    Tốc độ dòng: 1,25 ml/phút.
*    Detector: 278nm.
*    Thể tích tiêm mẫu : 100^1.
Khi phân tích mẫu nước tiểu, tuỳ thuộc vào tùng trường hợp cụ thể, điều chỉnh pha động nếu cần.
–    Phương pháp phân tích đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu qui định cho phép phân tích dịch sinh học: đặc hiệu, độ đúng, chính xác và ổn định.
–    Bằng thực nghiệm, đã xây dựng được kỹ thuật thao tác an toàn trên động vật [giống chó nhà], kỹ thuật cho uống thuốc, lấy mẫu máu với 2 kỹ thuật có bộc lộ và không bộc lộ tĩnh mạch. Xây dựng tiêu chuẩn chuồng, điều kiện để có thể lưu giữ theo thiết kế của thử nghiệm TĐSH, đảm bảo khả năng sử dụng động vật thay thế khi cần thiết trong đánh giá TĐSH cũng như các loại thí nghiệm khác cần thiết.
–    Đánh giá tính ổn định hấp thu của giống chó nhà. Thực hiện theo qui trình thử nghiệm đã xây dựng, giống chó nhà có đáp ứng tương đối phù hợp để sử dụng trong khảo sát TĐSH. Qua mô hình đánh giá TĐSH trên cùng một chế phẩm có chứa Notloxacin, kết quả cho thấy là tương đương với cả giá trị Cmax và AUC.
c,    Hiệu quả vể đào tạo
–    Đào tạo cho cán bộ của phòng Dược lý, viện Kiểm nghiệm về kỹ thuật xử lý mẫu, bảo quản và phân tích thuốc trong dịch sinh học. Các cán bộ đã tham gia đề tài đã có cơ hội để học tập, thực hành về kỹ thuật phân tích, thẩm định phương pháp và thiết kế nghiên cứu. Hiện nay tất cả đều đã có năng lực làm việc trong lĩnh vực này.
–    Phương pháp đã được sử dụng làm thao tác kỹ thuật mẫu cho lớp tập huấn của Tổ chức Y tế thế giới trong triển khai mô hình mẫu đánh giá TĐSH. Lớp tập huấn chủ yếu cho các cán bộ của Viện Kiểm nghiệm và Phân viện kiểm nghiệm, ngoài ra còn một số cán bộ của trường đại học Dược, doanh nghiệp cũng tham dự.
–    Một phần kết quả và kinh nghiệm thực hiện của đề tài đã được sử dụng trong 2 lớp tập huấn về Sinh khả dụng và Độ hòa tan của Viện Kiểm nghiệm tổ chức cho các cán bộ của Trung tâm kiểm nghiệm và một số doanh nghiệp.
–    Cán bộ của viện Kiểm nghiệm sau khi tham gia đề tài đã có được những kinh nghiệm nghiên cứu nhất định trong lĩnh vực này, có thể tham gia vào đào tạo cho các cán bộ của Trung tâm kiểm nghiệm hoặc các học sinh sau đại học.
d,    Hiệu quả về kinh tế
Kỹ thuật phân tích sẽ được áp dụng trong các nghiên cứu vể dược động học, tương đương sinh học và theo dõi điều trị.
Việc thử nghiệm và sử dụng thành công giống chó nhà trong khảo sát TĐSH thay thế cho giống chó thí nghiệm Beagle mà hiện nay chúng ta chưa thể nhập của nước ngoài [mà với giá thành rất cao] sẽ giảm chi phí nghiên cứu cho ngành công nghiệp dược.
e,    Hiệu quả vể xã hội
Phương pháp phân tích có khả năng áp dụng trong các thử nghiệm về TĐSH cũng như những nghiên cứu về dược động học, theo dõi điều trị. Khi đó, góp phần vào việc nâng cao chất lượng thuốc, nâng cao hiệu quả và chất lượng điều trị. Người bệnh sẽ  
được dùng những thuốc có chất lượng cao hơn, được hưởng những điều trị có chất lượng hơn. Đó thực sự là một trong những mục tiêu lớn mà chúng tôi mong đợi.
f,    Các hiệu quả khác
Sử dụng phương pháp phân tích, thực hiện mô hình mẫu đánh giá TĐSH một cách kịp thời theo kế hoạch của Tổ chức Y tế thế giới đã góp phần nâng cao uy tín của Viện. Chuyên gia của WHO đánh giá cao thao tác kỹ thuật cũng như năng lực phân tích của cán bộ viện Kiểm nghiệm qua lớp tập huấn này.
Thao tác kỹ thuật trên động vật và kỹ thuật phân tích thuốc trong dịch sinh học đã được giải nhất tại hội thao kỹ thuật liên viện ngành y tế thành phố Hà Nội.
Thao tác kỹ thuật trên động vật còn có khả năng được ứng dụng trong các nghiên cứu về tiền lâm sàng.
2,    ÁP DỤNG VÀO THỰC TIÊN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
–    Các kỹ thuật phân tích được áp dụng cho việc nghiên cứu xây dựng phương pháp và đánh giá các phương pháp phân tích.
–    Qui trình phân tích sẽ được áp dụng cho việc theo dõi dược động học của các cơ sở điều trị. Tạo điều kiện thuận lợi cho các thầy thuốc áp dụng phương thức điều trị mới, phù hợp và hiệu quả với từng trường hợp bệnh nhân.

MỤC LỤC
NỘI DUNG    Trang
PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ Nổl BẬT CỦA ĐỀ TÀI    1
1. Kết quả nổi bật của đề tài    1
a, Đóng góp mới của đề tài    1
b, Kết quả cụ thể    1
c, Hiệu quả về đào tạo    2
d, Hiệu quả về kinh tế    2
e, Hiệu quả về xã hội    2
f, Các hiệu quả khác    3
2, áp dụng ‘vào thực tiễn sản rtuất và đời sống xã hội    3
3, Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu vói để cương nghiên cứu    3
đã được phê duyệt    
a, Tiến độ    3
‘b, Thực hiện mục tiêu nghiên cứu    3
c, Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương    4
d, đánh giá việc sử dụng kinh phí    4
4. Các ý kiến đề xuất    4
PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu    5
ĐỀ TÀI CẤP BÔ
•    
1. ĐẶT VẤN ĐỀ:    5
1.1 Tóm lược nhũtig nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan    5
đến đề tài
Tính cấp thiết của đề tài    
1.2 Giả thiết nghiên cứu của để tài    6
1.3 Mục tiêu nghiên cứu    6
2. TỔNG QUAN ĐỂ TÀI    7

 
2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài    7
2.1.1 Nhu cầu nghiên cứu phương pháp phân tích trong dịch sinh học    7
2.1.2 Tổng quan về Norfloxacin    7
2.1.3 Phương pháp phân tích    9
2.1.4 Đối tượng dùng trong thử nghiệm tương đương sinh học    11
2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài    11
3, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu    13
3.1 Thiết kế nghiên cứu    13
3.1.1 Nghiên cứu khảo sát sơ bộ phương pháp phân tích    13
3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích    13
3.1.3 Khảo sát khả năng dùng chó ta để đánh giá sinh khả dụng và    14
TĐSH.    
3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu    14
3.2.1 Mầu thử nghiệm    14
3.2.2. Cd mẫu    14
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu    14
3.3 Phương pháp nghiên cứu    15
3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu    15
3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu    16
3.3.2.1 Khảo sát phương pháp phân tích    16
3.3.2.2 Đánh giá phương pháp    17
3.3.2.3 – Khảo sát tỉnh ổn định đáp ứng của chó ta với khả năng hấp    18
thu    
3.3.3 Các công cụ nghiên cứu cụ thể    19
3.4 Phương pháp xử lý số liệu    19
4. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu    20
4.1 Xây dụng phương pháp phân tích    20
4.1.1 Khảo sát và xây dụng phương pháp định lượng    20
4.1.1.1 Phân tích norfloxacin trong huyết tương    20
4.1.1.2 Phân tích norfloxacin trong nước tiểu    23
4.1.2 Kháo sát phương pháp chiết xuất    26

4.1.2.1 Phương pháp tạo tủa protein    27
4.1.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng    31
4.1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn    34
4.2 Đánh giá phương pháp phân tích.    43
4.2.1 Đánh giá phương pháp phân tích norfloxacin trong huyết tương    43
4.2.1.1 Tính đặc hiệu và tương thích của hệ thống    43
4.2.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn    45
4.2.1.3 Xác định giới hạn định tính, định lượng của phương pháp    46
4.2.1.4 Khảo sát độ chinh xác của phương pháp    47
4.2.1.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp    48
4.2.1.6. Khảo sát độ ổn định của norfloxacin trong huyết tương    50
4.2.2 Đánh giá phương pháp phân tích norfloxacin trong nước tiểu    51
4.2.2.1 Tính đặc hiệu và tương thích của hệ thống    51
4.2.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn    51
4.2.2.3 Xác định giới hạn định tinh, định lượng của phương pháp    52
4.2.2.4 Khảo sát độ chính xác của phương pháp    53
4.2.2.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp    54
4.2.2.6. Khảo sát độ ổn định của norfloxacin trong nước tiểu    55
4.3. Áp dụng phương pháp chiết xuất để khảo sát khả năng đánh giá TĐSH trên chó nhà    56
4.3.1 Nghiên cứu kỹ thuật thao tác thí nghiệm trên chó nhà    56
4.3.1.1 Bắt và cố định    56
4.3.1.2 Cho uống thuốc    57
4.3.1.3 Lấy mẫu máu    57
4.3.1.4 Lưu giữ và chăm sóc    58

4.3.2 Đánh giá khả năng đáp ứtig    59
4.3.2.1 Xác định các thông số dược động học    59
4.3.2.2 Phân tích thống kê và đánh giá tương đương sinh học    62
5. BÀN LUẬN    64
5.1 Về kỹ thuật chiết xuất    64
5.2 Về phương pháp định lượng    68
5.3 Khả năng dùng chó nhà để khảo sát TĐSH    69
6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ    73
6.1 Kết luận    73
6.2 Kiến nghị    74
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO    75